细胞增殖/毒性检测试剂盒CCK8 简称CCK-8 试剂盒，为MTT 法的替代方法，是一种基于WST（水溶性四唑盐，化学名：2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑单钠盐） ，是用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。

细胞增殖-毒性检测试剂盒  Cell Counting Kit-8(CCK-8/CCK8)

产品简介:

Cell Counting Kit-8 简称CCK-8 试剂盒，为MTT 法的替代方法，是一种基于WST(水溶性四唑盐，化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐) ，是用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。

水溶性四唑（2-（2-甲氧基-4硝基ben）-3-(4-硝基ben)-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑单钠盐），是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，被线粒体内的脱氢酶还原成橙黄色的水溶性的甲臜染料(formazan,下图)， 这种甲臜染料直接溶解在培养基中。水溶性四唑被细胞内脱氢酶生物还原后生成的甲臜能够。细胞增殖越多越快，则培养基的颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。正是利用这一特性开发的CCK-8试剂盒直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK-8法应用非常广泛，可以用于生物活性因子的活性检测，抗肿瘤药物的筛选，细胞增值的测定，细胞毒性检测以及药敏等与细胞活性和增殖相关的实验。本试剂盒使用方便，试剂盒包含一管已经配制好的含有水溶性四唑的CCK-8溶液，即开即用，无需其他准备步骤。检测过程也无需采用额外的步骤去溶解甲臜，可直接使用96孔板或者384孔板在酶标仪上检测，适合大规模高通量的样品检测。

CCK-8法与MTT比较：

CCK8试剂盒提供了一种灵敏度高，操作简便，使用安全，重现性好的细胞增殖与活性检测方法。与传统的MTT相比无需有机溶剂和放射性同位素，步骤少，无损失，结果准确！本试剂盒检测非常便捷。试剂盒仅一管已经配制好的含有WST-8的CCK-8溶液，无须再进行任何配制等操作 。无须使用同位素，所有的检测步骤仅在同一块96孔板内完成。不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外的步骤去溶解formazan。可以用于大批量样品的检测。

1.MTT实验生成的甲臜不是水溶性的，需要使用DMSO等有机溶剂溶解；而本方法产生的甲臜是水溶性的，不仅省去了溶解的步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差。

2.与MTT方法相比，本方法线性范围更宽，灵敏度更高。本方法对细胞无毒性，因此加入WST-8显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读数多次测定从而找到较佳测定时间。

3.本方法所用试剂在培养基中比MTT更加稳定，实验效果重复性好。

4.MTT具有毒性，同时其生成的甲臜需要有机溶剂溶解，会对操作人员身体造成危害。本试剂无毒，使用中无需有机溶剂，操作更加安全。

5.本试剂盒在4℃避光可长期保存，使用无需配制，即开即用。

6.酚红和血清对CCK法的检测不会造成干扰（扣除空白孔即可）

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常见问题与解答:

Q1.设定参比波长的目的是什么？必须要设定吗？        

A1.不一定要设定。 CCK-8试剂在参比波长处没有吸光度。设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。

Q2.如何设定空白对照？

A2.在不含细胞的培养基中加入CCK-8，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验 (细胞毒性实验) 时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中测定450 nm的吸光度作为空白对照。

Q3.在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？

A3.有时会有影响。如果药物具有氧化还原性，会和CCK-8发生反应，吸光度发生变化。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度，如果它的吸光度与不含药物的培养基（加CCK-8）的吸光度相比有明显变化，则证明药物有影响，可在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。

Q4.不更换培养基加CCK-8试剂，有没有问题？

A4.一般没有问题。但是如果培养基里有氧化还原性物质的话，可能会产生误差，必须更换其他培养基。我以下培养基会影响测定：培养基IMDM的空白吸收1.0；培养基McCoy/s的空白吸收0.3。

Q5.哪些物质会影响CCK-8的测定？

A5.当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，增加O.D.值；在有氧化性物质存在时会抑制测定反应的发生，减小O.D.值；在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可；血清不影响测定。

Q6.说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板或12孔板，应该加多少量CCK-8试剂？

A6.一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10.

Q7如何减少由于CCK-8试剂在枪头或者孔壁上的残留所带来的误差 ？

A7.可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。

Q8.每次测定的O.D值不一样，是什么原因？如何解决？

A8.可能会有以下几个原因：

1.当在培养箱中培养时，培养板较外一圈的孔较容易干燥挥发，导致培养基的体积不一样，从而增加误差。一般情况下，较外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。

2.有可能会因为CCK-8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。

3.每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1000-100000个/孔范围内摸索条件。

Q9.在CCK-8显色过程中，如何终止反应？ A9. 有以下几种方法：注意: 反应停止后, 应在24小时内测定。

1)每孔加10ul0.1M HCI溶液。2)在显色反应后，将培养板放入4℃冰箱内。3)每孔加10ul 1%(w/v)的SDS（十二烷基磺酸钠）溶液。

Q10.在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？

A10.缩短加入CCK-8后的培养时间。

Q11.必须预培养细胞吗？

A11.不一定。如果要想保持细胞的较好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞的预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有研究人员不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。

Q12.如果加入的药物中有金属，是否会有影响？

A12.金属对CCK-8显色有影响。终浓度为1mM的氯化亚铅、Fecl3、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10mM的话，将会100%抑制。

Q13.CCK-8的保质期有多久？

A13.CCK-8在避光0-5℃的条件下可以存放1年，在-20℃下避光可以保存2年。如果需要长期保存，我们推荐在-20℃储藏。正常的CCK-8颜色为浅粉色，如有明显颜色变化，则CCK-8的质量有可能发生变化。CCK-8若反复冻融有可能会增加空白吸收，从而影响检测结果，若短时间频繁使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。

Q14.预培养后，更换培养基需要细胞计数吗？

A14.一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数盘计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精确计数细胞，可以预培养后去培养基用血球计数盘进行计数。

Q15.CCK-8是否对细胞进行染色？

A15.CCK-8不对细胞进行染色。培养基中的CCK-8并不进入细胞内染色细胞，而是在电子载体的作用下被细胞中的脱氢酶还原为高度水溶性的黄色甲臜染料，是一个显色反应。显色反应后，更换新的培养基，可以继续培养细胞。

Q16.CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？

A16.不同细胞的脱氢酶活性不一样，显色程度不一样，灵敏度也不一样。

Q17.悬浮细胞和贴壁细胞在接种数量上有何区别？

A17.大部分悬浮细胞相比贴壁细胞比较难显色，O.D.值偏低，一般需要增加细胞接种数量或延长加入CCK-8后的培养时间。贴壁细胞显色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。

Q18.应该每次做标准曲线吗？

A18.建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样。对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。

Q19.有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？

A19.不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量，如果细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则实际测定的活细胞数量将会比真实值高，不能真实反应活细胞数量，建议采用别的方法测定。

Q20.CCK-8是什么颜色？  

A20.应该是粉红色。若颜色不一样，有可能会影响测定。

Q21.导入基因后，是否用CCK-8来检测活细胞？    

A21.可以

Q22.在pH5的培养基中培养细胞，是否可以用CCK-8试剂检测？

A22.理论上可以的，但是需要做标准曲线进一步确定。

Q23.O.D.值在什么范围比较合适？

A23.一般情况下O.D.值在0.1-2.0范围内都可以，在1.0附近较好。

Q24.细菌是否会和CCK-8试剂发生反应？

A24.CCK-8不会和细菌发生显色反应。细菌防御系统强，不会发生还原反应

Q25.CCK-8试剂用于测定活细胞的数量，对于增殖期的细胞和静止期的细胞，有何影响？A25.一般情况下CCK-8试剂用于检测对数生长期的细胞。如果静止期细胞的脱氢酶活性和增殖期的细胞的脱氢酶活性有很大的 不同的话，则两者会有很大的差别。

Q26.如果O.D.值太低，可以采取什么办法？

A26.两个办法：1)适当增加细胞数量; 2)延长加入CCK-8后的反应时间。

Q27.在做药物毒性实验时，加入CCK-8培养一段时间后，检测时颜色没有变化，样品和空白O.D.值一样，是何原因？

A27.可能因素有2个：药物的浓度太高，细胞全部被杀死；如果药物有氧化性，则会抑制CCK-8试剂的显色反应，可以采取先更换培养基清洗掉药物，然后再加CCK-8试剂进行检测的方法。

Q28.如何避免细胞聚团现象？

A28. 1) 消化时间长一些。2) 细胞培养好后，手摇或设备摇匀。3)用枪头反复吹打，但要避免产生气泡。

Q29.做悬浮细胞的实验时，检测几天比较合适？

A29.由于不更换培养基长时间的培养，培养基中的氧气和营养会流失，会影响细胞的状态。建议培养4-5天左右，但要确定细胞数量是否已经达到饱和？如果需要长时间培养，因为容易蒸发，建议培养板的边缘孔不加细胞。

Q30.如何制作标准曲线？

A30.先取已知细胞数量的细胞悬液加入到培养板中，然后用培养基一次等比例稀释成一个系列浓度的细胞悬液，细胞培养一段时间后加CCK-8试剂，培养一段时间，等颜色发生明显变化后，用酶标仪进行测定，以细胞数量为X轴，O.D.值为Y轴，就可以做成一条标准曲线。

Q31.细胞数量太多会有什么结果？

A31.贴壁细胞如果接种太多，细胞在培养过程中容易长满而产生互相挤压的现象，导致细胞状态不好或者死亡。另外细胞接种太多容易产生O.D.值过高（甚至于超过仪器的检测范围）的情况。

Q32.BrdU法和CCK-8法有何区别？

A32.CCK-8法师通过检测对数生长期的细胞内的脱氢酶来反映细胞的活性，而BrdU法是检测细胞的DNA合成。CCK-8法只需要加入知己，通过比色法就可以检测，而BrdU法不仅要加入试剂，而且要固定细胞，通过抗原抗体反应之后用发光法来检测。两者的原理是*不同的。如果只是检测细胞增殖的话，那么CCK-8的方法是比较简单的。

Q33.在做药物毒性实验时，药物对细胞有抑制作用，但检测结果却是O.D.值升高，为什么？

A33.很可能药物和CCK-8试剂发生了反应，可以做一个只加药物的空白对照，如果O.D.值确实比正常的空白对照O.D.值高很多，则说明药物和CCK-8试剂发生了反应。可以通过更换培养基清洗掉药物的办法解决。

Q34.加入CCK-8试剂后，为什么在不同时间检测的值不一样（例如在3小时和在3.5小时）？ A34.由于CCK-8试剂和细胞内的脱氢酶反应是一个循环反应，随着时间的增加，O.D.值也会不断增加，颜色会不断加深，但细胞数量却没有什么太大变化。一般情况下建议在确定较佳的实验条件（合适的时间、合适的O.D.值）后，把加入CCK-8试剂后的培养时间固定下来，以后在同样的培养时间点进行检测。

Q35.组内数据差异比较大或组间数据杂乱，没有规律，是何原因？

A35.原因有可能是CCK-8试剂在移液枪的枪头上或培养板的孔壁上残留，加入时较好快速加入以避免残留，可以用培养基稀释CCK-8试剂的办法来降低误差：用培养基稀释CCK-8试剂1倍，混匀后每孔加20ul使用。

Q36.用CCK-8试剂做细胞毒性检测时：1）贴壁细胞预培养多长时间合适？2）预培养过程中细胞分裂，如何计算细胞数量？3）如果预培养时间太长，会有什么结果？

A36. 一般情况下建议贴壁细胞预培养的时间为24h. 如果只计算药物的LD50值的话,可不必考虑预培养过程中的细胞分裂问题,但要做一个加细胞的对照(该值为较大值)。 如果预培养时间太长，有可能细胞会增长过多，达到饱和状态，O.D.值将会很高，甚至会超过仪器的检测范围。

Q37.在实验中加入刺激细胞增长的因子，但是细胞数量却没有增加（或者吸光值没有上升），为什么？

A37.首先用显微镜观察一下，确定细胞数量是否增加？然后才考虑其他的因素（如果加入的刺激因子和CCK-8发生反应的话，吸光值不变这种可能性是非常低的）。如果显微镜下观察细胞数量确实增加了，则请检查加入的药物是否具有氧化性？有可能抑制了CCK-8试剂的反应。方法是：在有细胞的培养基中做1个加药物和不加药物的对比，然后分别加入CCK-8试剂进行检测，如果不加药物的O.D.值比加药物的O.D.值高，则说明药物确实具有氧化性，产生了干扰。

Q38. Cell Counting Kit-8法实验中每孔应该接种多少细胞？

A.38贴壁细胞每孔至少需要接种1,000个细胞 (100 mL的培养基)，检测白细胞时由于它的灵敏度较低，每孔至少需要接种2,500个细胞 (100 mL的培养基)，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量。如果要使用24孔板或是6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

Q39.  哪些物质会影响CCK-8的测定？

A39. 当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，增加OD值，例如含有维生素C的Glucose等 (一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定 )。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。

Q40. 在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？

A40有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK-8试剂发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基 (只加CCK-8) 的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。

Q41. CCK-8对细胞是否有毒？

CCK-8对细胞的毒性相当低。 CCK8溶液自身因为高浓度的1Methoxy PMS的存在而具有一点毒性。但是，加到培养基中的CCK8是没有毒性的，因为被稀释了10倍。因此，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK8检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK8的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK8培养后的活力。

Q42.. Cell Counting Kit-8试剂稳定吗？

A42. CCK-8在避光0～5℃的条件下可以存放1年，在-20度下避光可以保存2年。反复解冻和冰冻将会增加空白吸收，从而影响检测结果，若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。 在常温下可以保存3周左右，颜色应该为浅红色，如果颜色发生改变，则可能会增加空白吸光度。

Q43.  我没有450 nm的滤光片，还可以使用哪些其他的滤光片？

A43可以使用吸光度在430～490 nm之间的滤光片，但是450 nm滤光片的检测灵敏度较高。

Q44. CCK-8能否对活细胞进行染色?

A44不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性的四唑盐，并通过电子载体将活细胞中的电子交换到培养基中的CCK上，因为CCK及其生成的甲瓒染料是高度水溶性的，不会进入细胞内，所以CCK-8不能对活细胞进行染色。

Q45. 如果OD值太低，可以采取什么办法？

可以采取2个办法：  适当增加细胞数量和 延长加入CCK试剂后的染色时间。