缺氧探针检测试剂盒说明书

缺氧探针检测试剂盒

Hypoxyprobe, Inc.（缺氧探针公司）是一家致力于为氧代谢紊乱引起的恶性和正常组织疾病提供诊断和治疗工具的小公司。公司位于美国马塞诸萨州伯灵顿（121 Middlesex Turnpike, Burlington, Massachusetts, USA 01803），属于美国国际天然药物公司（Natural Pharmacia International, Inc.，NPI）缺氧探针部门的衍生公司。 Hypoxyprobe, Inc.（缺氧探针公司）的成立起源于James Raleigh教授（任职于查珀尔希尔（Chapel Hill）北卡罗莱纳大学放射肿瘤学部门）和NPI（当时位于北卡罗莱纳Research Triangle Park）之间的合作。起初的合作着重于肿瘤缺氧的临床研究。NPI大规模生产缺氧探针Pimonidazole HCl，而James Raleigh教授保护的抗体，特异性检测人肿瘤上结合Pimonidazole的缺氧细胞。总体来说，使用Pimonidazole HCl作为缺氧标记物，用在狗、大小鼠上的临床前研究越来越受科研圈的关注。2002年NPI授权五年给Chemicon公司销售缺氧探针试剂用于动物研究。2006年预测到市场对缺氧探针试剂的扩张需求，NPI终止chemicon授权并成立Hypoxyprobe, Inc.（缺氧探针公司）以开发更优秀且更宽广的试剂用于动物和临床研究。如今的Hypoxyprobe, Inc.（缺氧探针公司）专注于研发非侵略性的缺氧标志物（Hypoxia maker）和缺氧依赖性的细胞因子，所有产品皆基于Pimonidazole核心结构来开发。

特色产品：

HypoxyprobeTM-1 Plus Kit 缺氧探针检测试剂盒

关键词：

Hypoxyprobe, Inc.（缺氧探针公司）；Pimonidazole HCl；缺氧标志物，（Hypoxia maker）；Chemicon Inc，派诺硝唑，低氧探针，缺氧探针，乏氧探针

产品应用：

免疫化学法检测细胞和组织缺氧情况，包括免疫荧光（IF），免疫组化（IHC），WB或流式细胞分析（FC）。

试剂盒组分：

试剂盒组分详细描述：

1、Hypoxyprobe-1

Hypoxyprobe-1是2-硝基咪唑的替代物，其化学名和成分是Pimonidazole hydrochloride（Pimonidazole HCl，派诺硝唑），分子量为290.8，水溶性为400mM（=116 mg/ml），紫外吸收（324nm）的吸光系数为7020（0.9%生理盐水）。

Hypoxyprobe-1的粉末和溶液形式皆具化学稳定性。比如，固体形式的Hypoxyprobe-1于柔弱光线下室温保存2年，UV和HPLC分析法评估无任何降解发生。溶于0.9%生理盐水的Hypoxyprobe-1，浓度100g/L置于2-8℃保存4.5年，UV和HPLC分析法评估无任何降解发生。

2、FITC-MAb1抗体

FITC-MAb1是FITC偶联的抗派诺硝唑探针的小鼠IgG1单克隆抗体（克隆4.3.11.3），浓度为0.5mg/ml（in PBS）。可用免疫组化检测（IHC），冰冻切片或者福尔马林固定的石蜡包埋切片；也可组织降解后用流式分析法检测；

3、Anti-FITC HRP抗体

本抗体为偶联HRP的兔抗FITC IgG多克隆抗体。用于检测福尔马林石蜡包埋的小鼠肿瘤组织，不仅有强荧光信号，且背景极其低。

检测原理：

低氧标志物测定(hypoxia markers)是利用还原硝基有选择性结合乏氧细胞的能力而形成的一种从细胞水平测定肿瘤乏氧的技术，其原理是：肿瘤乏氧细胞还原能力强，当具有电子亲合力的硝基咪唑主动扩散透过细胞脂膜，在细胞内硝基还原酶作用下，硝基被还原，还原产物与大分子物质不可逆结合，滞留在组织内。而正常含氧细胞亲电子硝基咪唑还原产物立即被氧化，从而用硝基咪唑类化合物在肿瘤内的代谢程度来反映肿瘤的乏氧。

Pimonidazole是新型的乏氧细胞标记物，HPI公司拥有硝基咪唑类化合物特异性抗体，该抗体为公司技术，在此基础上公司开发了不同标记的特异性抗体，方便可用：利用免疫组织化学，酶联免疫吸附试验和流式细胞仪技术分析对肿瘤细胞分析检测

使用指南：

1、 Animal Studies 动物研究

研究正常或肿瘤组织缺氧首先通过静脉注射（intravenous infusion）、腹腔注射（intraperitoneal injection）或口服（oral ingestion）法给Hypoxyprobe-1溶液，剂量为60mg/kg体重。比如，25g小鼠的探针用量为1.5mg/只小鼠。（高达400mg/kg的剂量用于小鼠无可见毒性或引起组织缺氧变化，但60mg/kg以成本给予良好的染色结果）。

给药后，Hypoxyprobe-1分布到包括大脑的所有组织，且仅仅在氧浓度≤14μM（相当于pO2=10mm Hg，37℃）的细胞内与蛋白质巯基形成加合物。除了肿瘤之外，正常组织如肝脏、肾脏和皮肤含pO2等于或低于10mm Hg的细胞，也会结合Hypoxyprobe-1。

2、Tissue cultures 组织培养

通常情况下，细胞悬液置于含100-200μM Hypoxyprobe-1的缺氧环境中孵育1-2h。之后细胞离心涂片、固定、FTIC-MAb1和anti-FITC chromogenic secondary染色。

常见问题解答（FAO）：

※Hypoxyprobe-1 探针如何溶解？

Pimonidazole HCl 是弱碱性盐酸盐，水溶性非常好，建议溶解于116mg/ml 的中性生理盐水。

※Pimonidazole HCl免疫剂量是多少？

对于常规的小动物大小比较均一的，例如：小鼠或大鼠，我们推荐：探针用量：60 mg/kg。从30 mg/kg 到 400 mg/kg在小鼠和大鼠都有用到，在此范围内的探针用量，不会由于血流效应而导致毒性或氧量的改变。对于体型较大个体，注射剂量依据个体的基础表面积而定。对于人样本，推荐剂量为：0.5 mg/m2，狗样本：0.28 mg/m2

※  Pimonidazole HCl 探针是否能够渗透进入低氧大脑组织或脑肿瘤组织？

 Pimonidazole HCl可以自由渗透进入脑和脑肿瘤组织。

※探针注射后，多久可以进行收获组织？

 对于人体组织的一些研究表明，收获组织需要在免疫后15-24小时后检查。探针在血浆中的半衰期是5小时，因此16-24小时相当于3-5个探针半衰期循环。也就是说：在组织检查时：大概有1/8 到1/32 的探针仍存在，冷固定后，这样减少了非特异性染色，且低背景。

另外关于人类肿瘤研究表明，活组织检查应该在免疫后，1.5-4小时，然后组织及时转到液氮固定。这种方法背景也较低。小鼠血浆中的探针半衰期在0.25小时。这种情况下，采取1-2小时收获组织然后采取快速固定方法，可有效的消除背景。