佐剂诱导的关节炎（AIA）

佐剂诱导的关节炎（AIA）

背景介绍

1956年，Pearson 发现用*佐剂免疫大鼠可诱发关节炎。这种关节炎模型，被称为佐剂诱导的关节炎，被广泛用作关节炎研究的动物模型。AIA 也可用其他的其他细菌诱导：比如丁酸、表皮葡萄球菌等。Kohashi等研究发现：肽聚糖是这些细菌细胞壁中共同的致病因素，肽聚糖衍生物MDP中具有较低的致病性。

通过引入关节炎大鼠的T细胞（不是血清抗体）可以再正常的大鼠诱导关节炎。关节炎性T细胞识别结合菌65kDa热休克蛋白的抗原表位（180-188残基），这个表位结构与结蹄组织中蛋白聚糖连接态的结构相同。这表明，T细胞对自体成分有免疫应答，有助于诱发关节炎。

备注：

以前，AIA被用作关节炎研究的动物模型，但这种关节炎被认为是反应性关节炎而不是真正的关节炎。研究表明：AIA动物模型与真正的关节炎在组织学和免疫学特征上是有区别的。AIA模型用于外部因素激发的导致的自身免疫应答机制研究。

实验动物供应商

即使是同一品系，不同供应商提供的大鼠在遗传背景上和菌群上也不同。这种差异导致实验结果上的差异。Chondrex 推荐客户在批量实验前，先做预实验，比较不同供应商实验动物的差异。

室内条件

环境因素的影响对于AIA模型也非常重要。比如：无菌的Fisher 344(F344)大鼠对AIA非常易感，SPF动物条件和常规的动物条件， 会产生严重的关节炎。传统的动物条件也会诱发F344大鼠发生关节炎，但是严重程度和发病率要相对低于20%。

大鼠品系和日龄

Lewis、SD、Wister 及BN大鼠被认为是AIA诱导的易感品系。 BUF、F344及糖尿病大鼠是中度和轻度的易感品系。易感性因动物供应商、免疫剂量及分枝杆菌的来源和制备方法的不同而不同。推荐6-12周龄的大鼠用于诱导AIA模型。大鼠幼鼠（1-7日龄）不易感，而老龄鼠（≥9个月）相对抗性太强。

注：Dark agouti(DA)大鼠对AIA（*佐剂诱导），CIA（胶原诱导）,OIA(不*佐剂诱导)的关节炎都非常易感。这个品系的关节炎病理机制与其他品牌诱导的AIA模型可能是不同的。因此，如果用DA大鼠诱导AIA模型做研究比较复杂，需要考虑更多的影响因素。

           常用的诱导AIA动物模型的品系

佐剂

A.油剂类型

矿物油的来源也是影响AIA造模的关键因素。弗氏不*佐剂（cat7002#）常被用于相应的油剂，但是可用于生物降解的植物油，例如：橄榄油也可以用作佐剂。有报道表明用海鲛油剂诱导低敏感性的F344大鼠非常有效。但在实际应用中，矿物油，海鲛油，液体石蜡对于诱导易感品系的大鼠具有相同的效果。

B.结核杆菌

不同来源的分枝杆菌分离出的肽聚糖、胞壁酰二肽（MDP），都被用作抗原诱导AIA.。灭活的分枝杆菌颗粒大小是影响AIA造模的重要因素。小的颗粒相比大颗粒或聚合物具有更好的免疫原性。为了有效诱导AIA模型，推荐结核杆菌浓度至少5mg/ml。 10mg/ml(cat#7027)被广泛应用于AIA模型诱导。

注：1mg/ml 的*佐剂，由于结核杆菌浓度太低，很难有效诱发AIA模型。

免疫方法

通过单次尾根部皮下注射，对易感品系很容易诱发AIA动物模型，对于一些不敏感的品系，佐剂需要进入淋巴系统才能产生免疫应答。研究表明，对于F344这种不敏感的品系，淋巴系统免疫佐剂比常规足垫免疫诱发AIA更有效。

每次免疫前都需要重悬佐剂，保证结核杆菌混匀，如果没有重悬，佐剂中的结核杆菌分布不均匀。

注：乳化佐剂

AIA模型不需要对佐剂进行乳化。但是为了避免出现结核杆菌分布不均匀的问题，*佐剂常与生理盐水或缓冲液等体积制备乳剂用于诱导AIA。有报道用*佐剂与肽聚糖或MDP混合制备乳剂诱导F344大鼠的AIA模型。关于乳剂的制备方法，请参考A部分“乳剂制备操作流程”

佐剂诱导的关节炎操作流程（AIA）

A.佐剂制备

Chondrex公司提供10mg/ml （cat#7027）和20mg/ml(cat#7024)，在注射之前混匀佐剂，确保结核杆菌均匀分布。

B．注射

选择足底免疫还是尾根部免疫取决于具体的研究目的。

1.足底免疫

后爪足垫皮下免疫0.05ml *佐剂(cat#7027 10 mg/ml)。针头应插入足垫皮下指向脚踝方向：这样能够保证佐剂引流到淋巴结。30min内会看到严重的急性炎症反应，高峰期3-4天，通常情况下回持续20-25天。免疫的后爪不能作为评分标准，因为即使其四肢都没有肿胀，免疫的后爪也会发生肿胀。

免疫后12-14天在未注射的爪子发生肿胀，高峰期2-3天，关节炎会持续20-25天。但是有一些大鼠会反生由骨膜反应引起的慢性骨性肥大。

2.尾根部免疫

尾根部皮下免疫0.05ml *佐剂(cat#7027 10 mg/ml)。这种方法的有点是能够使4只爪子都发生肿胀。免疫后12-14天在爪子发生肿胀，关节炎会持续20-25天。

注：如果用（cat#7024 20 mg/ml）佐剂免疫，注射体积应降低一半。

            图1.尾根部皮下免疫

C．关节炎评估

1）评分：

关节炎严重程度可以通过外观评分。10-25天，通过日常观察，评估疾病的发展进程。如果采取尾根部免疫，四肢都要做评分（0-4分）：0分：正常 1分：中度关节炎 4分：严重的关节炎。尾根部免疫关节炎评分高分为16分（4只爪总分），如果采取足垫免疫评分高为12分（免疫的爪不做评分）。除每日评分外，在实验结束后，记录每个爪的评分。后者反应了关节炎的炎症的加重程度，特别是前后爪发病不同步的时候。

2）足趾厚度和体积评估

足趾肿胀也可以通过测定足趾厚度和体积进行评估，可以采用足趾测量仪或体积测定仪进行测定评估。

3）局部热疗评估

局部热疗评估是是非常准确的检测炎症程度的指标，这种方法操作简单且非常灵敏。可以用：接触式温度计测量爪子表面温度。

                         图2.AIA模型的抗炎症药物评估

用0.05ml 10mg/ml的佐剂诱导的SD大鼠的AIA模型。0-20天每天口服抗炎症药物（E-5110: 3 mg/kg)。通过测定1-20天，后爪（左）的炎症和14-20后爪（右）炎症反应评估药物效果。红色：对照大鼠 紫色：药物处理的大鼠。

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