ALPORT综合症 IV型胶原免疫组化染色试剂盒

产品名称：ALPORT综合症IV型胶原免疫组化染色试剂盒

生产厂家：EURO Diagnostic

产品货号：ALP105

1 简介

试剂盒适用于ALPORT综合症肾组织和皮肤组织切片的染色，有助于ALPORT综合症的诊断。患有ALPORT综合症的病人，IV型胶原的α5 链发生基因突变，这会导致IV型胶原α5 链在肾小球基底膜和皮肤基底膜以及IV型胶原α3 链在肾小球基底膜的低表达。

2 试剂盒组成及试剂保存

IV型胶原α1链单抗 （MAB1） 1 ml

IV型胶原α3链单抗 （MAB3） 1 ml

IV型胶原α5链单抗 （MAB5） 0.5ml

甘氨酸/尿素 稀释液    2x23ml  (低温保存，尿素易缓慢分解)

3 切片的染色

3.1 冰冻切片的染色

 1）冰冻组织切片（3μm），晾干，丙酮固定10min，PBS 冲洗。

 2）Mab5 染色的切片，用冷的甘氨酸/尿素 稀释液变性，孵育5min，蒸馏水洗涤。

 3）加入MAB1、MAB3、MAB5（一般1/25-1/75PBS 稀释）孵育1小时，PBS洗涤。

 4）加入FITC 标记的抗鼠二抗，孵育1小时。

 5）PBS洗涤，加入含有对苯二胺的封片剂，以延长荧光淬灭时间。

 3.2 石蜡切片的染色

 1）切片脱蜡至水用于染色。（3-4μm）。

 2）抗原修复-分两种方式完成

   蛋白酶缓冲液的制备：

   25mg 蛋白酶XXIV(Sigma P8038 ) + 25mg Cacl2 + 45ml 蒸馏水+ 5ml 0.05M Tris-HCL 缓冲液 PH7.6。混匀，加热到37℃。

  a. MAB1 和MAB3 切片置于柠檬酸盐缓冲液中（PH2.0 ），微波炉750W 加热8min，随后350W 15min，（用Dako 公司的S2031柠檬酸盐缓冲液PH6,用1M HCl 调 PH到PHJ2.0）,（转到第3步）

 b. Mab5: 切片置于柠檬酸盐缓冲液中（PH2.0 ），微波炉750W 加热8min，随后350W 5min，蒸馏水漂洗2次。加0.05%蛋白酶缓蛋白酶XXIV冲液（Sigma P8038）,微波炉加热37℃ ，5min。蒸馏水漂洗5分钟。加甘氨酸/尿素 稀释液（试剂盒提供）4-6℃，孵育10min. 蒸馏水漂洗2x2 min。

  3）用1.5% H₂O₂ (TBS稀释) 封闭10min，灭活内源性过氧化物酶。自来水漂洗5min，蒸馏水漂洗1min。

  4）1：50 稀释MAB1和MAB3，1：200稀释MAB5，孵育25min。

用Dako 公司的Envision Flex Kit 显色试剂盒

  5）加入Envision Flex +Mouse (SM804,Dako),25 min.

  6) 加入Envision Flex +Mouse (SM802,Dako),20 min.

  7）加入底物工作液(mix)(SM803,Dako),5min x2.

  8) 加入Envision Flex苏木精复染（SM806,Dako）,5min.

4 说明：

为了更准确的解释实验结果，需在实验时做阴性对照（不加一抗）和阳性对照（MAB1）。阳性对照是为了说明样本的处理和染色操作的正确性。在肾小球基底膜着色较强。阴性对照用于排除一些非特异性染色。

MAB3 和MAB5 正常情况下在整个肾小球基底膜都是着色的。对于ALPORT综合症X染色体显性遗传病人来说，男性样本不着色，女性样本着色成不连续分布。对于常染色体阴性病人，MAB5在肾小球和集尿管基底膜囊成阳性，而MAB3成阴性。

MAB3一般在皮肤组织中成阴性，而MAB5在皮肤组织中成阳性。对于X染色体显性遗传病人来说，男性样本通常成阴性，女性样本部分着色。对于常染色体的阴性遗传病人来讲，MAB5通常在皮肤基底膜染色。

表1

¤抗5α链抗体着色出现在肾小球囊和集合管基底膜。