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游离蛋白S检测试剂盒 （ADI）
更新时间：2014-12-08
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AAmerican Diagnostica GmbH,ADI 公司
Freee Protein S ELISA (Cat.no 842)中文说明书
（中文说明书供参考，请以英文说明书为准）
简介，检测原理（略）
试剂盒组成：
- 96孔板
- 2瓶Protein S 样品稀释液，即用型50ml
- 3瓶Protein S校准品
- 1瓶Protein S高值质控
- 1瓶Protein S低值质控
- 3瓶抗人Protein S-HRP 二抗
- Protein S二抗稀释液（15ml）
- 1瓶，20X洗涤液(50ml)
- 1瓶TMB底物溶液 （25ml）
- 1瓶终止液（6ml）
试剂准备和保存
- 微孔板：铝铂拆开后，板条应该在30min内使用。不用的板条按2-8℃在原包装袋内（含干燥剂）密封，防潮可保存4周。
- Protein S样品稀释液：即用型，一旦开盖，2-8度可稳定4周。
- 校准品：每瓶校准品，用Protein S 样品稀释液2ml重悬。校准品含量相当于正常血浆1:50稀释后的量。重悬后的校准品室温（18-25℃）可保存8小时。
- Protein S Control I：用滤过的去离子水0.5ml重悬该质控品。重悬后的质控品室温（18-25℃）可保存8小时，2-8℃可保存24小时，-20℃无菌条件可保存2月。
- Protein S Control II：用滤过的去离子水0.5ml重悬该质控品。重悬后的质控品室温（18-25℃）可保存8小时，2-8℃可保存24小时，-20℃无菌条件可保存2月。
- Mab anti-Human Free Protein S-HRP：用4ml Protein S Conjugate Diluent，重悬该抗体。轻摇，重悬后的二抗室温可保存24小时，2-8度可保存4周以上。
- Protein S Conjugate Diuent：即用型，开盖后，2-8度可保存4周以上。
- Protein S Wash Solution：如果瓶内有沉淀或固体物质，37度水浴15-30min，轻摇瓶管，1:20用双蒸水稀释(50ml，稀释后可制备1L的稀释液)原管内2-8度保存，开盖后后保存4周，稀释后的稀释液，2-8度可保存7天。
- TMB显色底物：即用型，一旦开盖，2-8度可保存4周以上。
- 终止液（0.45M H2SO4）：即用型。
样品收集和制备
柠檬酸抗凝的血小板缺乏的血浆或血清适用于该实验。
血浆按以下方式制备：
- 按血：柠檬酸钠（3.2%）=9:1的比例，收集样本
- 2500g 离心20min
- 血浆需2-8度保存，4小时内做检测。或血浆保存于-20度，6个月内检测。
- 冻的血浆需37度，迅速解冻。解冻的血浆2-8度保存，4小时内做检测。
检测的样本和Protein S control需用protein S 样品稀释液1:50稀释，如果样品浓度可能高于100%，需做高浓度稀释。如果样本浓度x＜10%，样本只需做小于1:50低浓度稀释
校准品制备
Free Protein S 浓度以占血浆百分比（%）表示，。100% Free Protein S浓度相当于：正常血浆（混合池）1:50稀释后的浓度。
按一下方式制备校准品：
Free Protein S（%） | C | C/2 | C/4 | C/10 | C/20 | 0 |
校准品加入量 | 1ml | 0.5 ml | 0.25 ml | 0.1 ml | 0.05 ml | 0 |
校准品稀释液加入量 | 0 ml | 0.5 ml | 0.75 ml | 0.90 ml | 0.95 ml | 1.0 ml |
充分混匀，标准品稀释液室温稳定性至少4个小时（18-25℃）
操作流程：
- 依据做的标本数量，拆去多余的板条，置于提供的板条架上。
- 剩余检测孔，按以下操作流程操作。
试剂 | 加入量 | 流程 |
Anti-Human Free Protein S-HRP | 100ul | 每孔加入100ul Anti-Human Free Protein S-HRP |
Protein S Standard diluted sample 或Protein S sample diuent(blank) | 100ul | 立即加入100ul ProteinS 标准品和检测样本至对应孔 |
室温（18-25℃）孵育1小时（手动轻震板或振板器振板） | ||
Protein S 稀释液 | 300ul | 洗板5次 |
TMB底物显色液 | 200ul | 洗涤完毕后，立即每孔加入200ul底物显色液 |
室温（18-25℃）孵育5min() | ||
0.45M H2SO4 | 50ul | 加入0.45M H2SO4终止液 |
等待10min待颜色稳定，450nm测定吸光度，减去空白吸光度。 | ||
注意：
- 在孵育的时候，特别是显色的时候，避免微孔板强光照射。
- 在加入试剂前或洗涤前，不要使板干透。随后加入的时间应在3min内完成，避免微孔板太干燥。如果已干燥，在加入新试剂前，需加入洗涤液，然后去掉。
- 每排板孔，加入TMB底物的时间间隔需要测定。终止时间要相同
结果：
以Protein S 标准品浓度（%）做横坐标，平均吸光度做纵坐标，每次检测都需要重新做标准曲线，如图所示。
计算：
从曲线可直接计算出ProteinS 的浓度（样品按：1:50稀释）。如果样品做了高浓度的稀释，需乘以对应稀释系数D(例如：样本做了1:100稀释后，测值需乘以2，1:200稀释后，测值需乘以4) 。如果做低浓度的稀释，得到的检测值需除以稀释倍数。
检测程序的局限性：
因为盒子内的单抗是钙依赖性单抗，所以请用盒子里自带的Wash Buffer (含钙)。如果洗涤不充分，得到的样品检测OD值会很高，为避免非特异性显色，请确保洗涤的充分性。
测值：
血浆中Protein S 浓度正常值：60-150%，因此非正常值＜60%。一般男性测值会高于女性，且随年龄和血脂浓度增加。
