免疫组化染色注意事项

免疫组化染色注意事项:
免疫组化染色方法已不是什么很难的问题，操作步骤简单也易掌握，但要染好免疫组化，其中方法的技巧将是每位操作者在实际工作中不断摸索和探讨的事：
（1）去除内源酶及内源性生物素　
一般我们进行免疫组化标记的都是一些生物体组织，其中自身含有一定量的内源酶和内源性生物素，而免疫组化各种染色大部分是用过氧化物酶来标记抗体的，酶的作用是催化底物，使显色剂显色，而组织中的内源性酶同样也能催化底物，使其显色，这就影响免疫组化的特异性，所以在标记抗体的过氧化酶进人组织切片之前就应设法将组织内的内源性各种酶灭活，以保证免疫组化染色在特异性情况下进行。
1) 去除内源酶　
常用的去除内源性酶的方法是3%过氧化氢水溶液。但在含有丰富血细胞的标本中，由于其中含有大量的具有活性的过氧化物酶，能与过氧化氢反应，出现气泡现象，易对组织结构和细胞形态产生一些不良影响，但用3%过氧化氢的方法，能够去除大部分内源性酶，即使有些血细胞在显色后也出现棕黄色反应，但由于其形态结构与组织细胞不同，也易鉴别，而且此方法比较通用易操作，但应注意过氧化氢的浓度不能过高，一般为3%一5%，时间不宜过长，室温10min。
2) 去除内源性生物素　
在正常组织细胞中也含有生物素，特别是肝、脾、肾、脑，皮肤等组织中，在应用亲和素试剂的染色中，内源性生物素易结合卵白素，形成卵白素一生物素复合物，导致假阳性，所以在采用生物素方法染色前也可以将组织切片进行0.01%卵白素溶液室温处理20min，使其结合位点饱和，以消除内源性生物素的活性。
3) 灭活碱性磷酸酶　
zui常用的方法是将左旋咪挫(以每毫升加24mg)加入底物液中并保持pH值为7.6~8.2，能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶可用0.05mo1/L酒石酸抑制。
（2）抑制非特异性背景着色　
非特异性着色zui常见的情况是抗体吸附到组织切片中高度荷电的胶原和结缔组织成分上，而出现背景着色，为了防止这种现象，用特异性抗体来源的同种动物灭活的非免疫血清在特异性抗体之前进行处理，以封闭荷电点，不让一抗与之结合，但这种方法一般实验室很难实现，一般常见实用的血清是2%~10%羊血清或2%牛血清白蛋白在室温下作用10~30min即可，但应注意此种结合是不牢固结合，所以不要冲洗，倾去余液直接加一抗，对于多克隆抗体来讲，易产生背景着色，在稀释特异性抗体时可采用含1%非免疫血清的pH7.4的PBS液。
（3）缓冲液　
免疫组化染色标记是对生物体组织抗原进行标记，抗原抗体的pH值为7.2~7.6，zui常用的是0.0l mol / LpH7.4磷酸缓冲液(PBS)。简易配法：5000ml蒸馏水中分别加入l g NaH2PO4、15.6gNa2HPO4 、42.5gNaCl。但如果是采用碱性磷酸酶(AP)作为标记物底物的方法时可以用0.02mol/L TBS pH8.2缓冲液比较好。
（4）抗原修复　
经甲醛固定的部分组织细胞，可使免疫组化标记敏感性明显降低，这是因为甲醛固定过程中形成醛键或保存的甲醛会形成羧甲基而封闭部分抗原决定簇。因此，在染色时，有些抗原需先进行修复或暴露。
抗原修复方法可分为化学方法和物理方法。化学方法是以酶消化方法，常用胰蛋白酶及胃蛋白酶，配制浓度与消化时间要适度。常用的物理方法有单纯加热、微波处理和高压加热。在选用这三种加热法时，浸泡切片的缓冲液的离子强度和PH值、加热的温度和时间均影响着抗原修复效果。目前zui常用的修复方法有如下凡种：
1）胰蛋白酶(Trpsin)　　
主要用于细胞内抗原的修复。一般使用浓度为0.1%，37℃作用10min。
配法：0.1g胰蛋白酶加入到0.1%pH7.8CaCl2(无水)水溶液中溶解后即可。
2）胃蛋白酶(Pepsin)　　
主要用于细胞间质或基底膜抗原的修复。一般浓度为0.4%，37℃作用30min。
配法：0.4g胃蛋白酶溶于0.lmol/L HCl水溶液中。
3）热引导的抗原决定簇修复(Heat Induced Epitope Retrieval，HIER)　
HIER对大多数的抗体有益，尤其是对核抗原的修复作用更加明显，zui常用的抗原修复液是pH6.0的枸橼酸缓冲液和pH8.0的EDTA缓冲液，它们的作用原理是通过钠离子的螯合而实现的。抗原修复液的pH值非常重要，有效的抗原修复pH值要比修复液的化学成分更重要，同样的修复液随着pH值的升高染色的强度逐渐增强，但*pH值范围为6.0~10.0，对于大多数抗原这个范围的pH值都能进行有效的修复，有些抗体(如Ki-67、ER)则在pH值l.0~3.0和6.0~8.0更为有效。作为通用修复液碱性pH值的修复液要比酸性的有效，而对固定很长时间旧的存档组织，酸性pH值的修复液则优于碱性的修复液，所以两种抗原修复液可作为相互替补的进行抗原修复。在进行HIER过程中应防止切片的干燥，加热时必须达到规定的温度，保温时间要足够，对于一些不要抗原修复的抗体不要采用HIER处理，否则对染色无益，但有些抗体则需要利用多种修复联合应用。
HIER方法有：
1)水浴加热法　
将脱蜡入水后的切片放人盛有修复的容器中，放人加热煮沸水中，当修复液温度达到95℃左右时计时l5min，自然冷却，PBS洗3min×3次。
2)微波加热法　
将切片放入修复液中微波加热使温度在96℃左右，计时l0min，在微波炉中停留2min，室温自然冷却，PBS洗3min×3次。
3)高压加热法　
将修复液在高压锅中煮沸，切片插在染色架上，放入锅中(要使修复液淹没切片)开始喷气时盖上压力阀。计时2min，冷水冲至室温取出切片，PBS洗3min×3次。
（5） 显色　
免疫组化染色的显色是zui后的关键问题，一般辣根过氧化物酶(HRP)的检测系统选用DAB或AEC显色系统进行显色。但要得到*的显色效果，必须在镜下严格控制，以检出物达到zui强显色而背景无色为zui终点，尤其DAB显色时间短着色浅，时间长背景又深，都将影响结果判断，根据经验DAB在配制完后zui长宜放置30min以内，过时不能使用，DAB加到组织切片时作用时间zui长不宜超过10min(在5min内)，否则不管有无阳性都应终止反应。对一些含有内源性酶较高的组织用DAB显色时极易出现背景色更应尽早在镜下控制，以达到*的分辨效果（棕色）。AEC显色系统（红色）的弊端是易溶于有机溶剂，所以封片时应以水性封片剂为主，同时染色的切片也不能久存。
如果是碱性磷酸酶(AP)选用NBT/BCIP作为显色系统（结果染为蓝黑色）。
（6） 结果判断　
免疫组化的结果判断有两种方法：
一是对以检测结果阳性细胞指数来定性(如核抗原的标记)，判断方法是以一个视野中的阳性细胞数与总细胞的百分比，再取10个相同视野算取平均指数。
另一种方法以染色阳性强度和阳性检出率相结合而定，一般阳性细胞数在0~25为阴性，25~50为+，50~75为++，75以上为+++。此种判定方法容易出现人为误差现象。
有条件的实验室能用图像分析系统进行结果检测定量分析更为准确。一切的判定方法都是力求使免疫组化染色结果判断更标准，但各单位采取的标准不尽相同，所以判断标准化问题还有待长期实践中病理学术界商讨判定标准。
IHC中常见的抗原表达模式有以下几种：
1）细胞浆内弥漫性分布，多数胞浆型抗体的反应如此，如细胞角蛋白(cytokeratin，CK)和波形蛋白(vimentin)等；
2）细胞核周的胞浆内分布，其判别要点是细胞核的轮廓被勾画得很清楚，如CD3多克隆抗体的染色；
3）胞浆内局限性点状阳性，如CDl5抗体的染色；
4）细胞膜线性阳性，大多数淋巴细胞标记的染色如此，如CD20、CD45RO；
5）细胞核阳性，如Ki-67及雌、孕激素受体蛋白ER、PR等。一种抗体可同时出现细胞浆和细胞膜的阳性表达，如EMA可呈膜性和胞浆内弥漫性阳性反应；CD30抗体可同时呈膜性和胞浆内点状阳性反应等。
（7） 对照片的设置　
免疫组化的质量取决于正确使用各种对照，没有对照的免疫组化结果是毫无意义的。对照包括阴性对照、阳性对照和自身对照。在实践中可用染色组织切片中不含抗原的组织作为阴性对照，而用含抗原的正常组织作阳性对照，这种自我对照具有节约的意义。观察染色结果时，先观察对照组织的结果，如阳性对照组织中阳性细胞呈强阳性，阴性对照细胞呈阴性，内源酶阴性，背景无非特异性染色时，表明本次实验的全部试剂和全过程技术操作准确无误，待检组织中的阳性细胞也就是可信的正确结果。 免疫组化染色中对照片的设置非常重要，它是判断您的染色是否成功的关键依据，而且也是检测每一个抗体的质量标准，常设的对照如下，一般实验zui常用的只选第二种方法。
1）空白对照(阴性对照)　 *抗体由PBS或非免疫血清取代。
2）阳性对照　 用已知含有要检测抗原的切片作阳性对照。
3）回收实验阴性对照　已知抗原与相应的*抗体混合，发生结合沉淀，再用此沉淀抗体复合物进行免疫组化实验，结果为阴性。
4）替代对照　用于*抗体同种动物的血清或无关抗体代替*抗体结果为阴性。
5）自身对照　在同一切片上，应将不同组织成分中的阳性或阴性结果与检测的目的物对照比较。如actin、CD34在正常组织中的血管壁肌层应为阳性，vimentin可以间质细胞，对照desmin以血管壁及肌束为对照，S-l00蛋白以小神经末梢为对照等，如果应为阳性的组织是阳性，则免疫组化技术正确，如为阴性，则表明染色技术有问题或免疫试剂质量有问题。

免疫组化技术要点:
1. 固定
用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
（1）BouinS固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
（2）PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2. 组织脱水、透明
时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
3. 切片时展片
有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4. 烤片
60℃ 30分钟或37℃ overnight，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
5. 蜡块及切片的保存
在4℃保存
6. 脱片问题
Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中zui常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1:50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
7. 灭活内源性酶
（1）HRP系统：3%双氧水灭活
（2）AP系统：3%HAc灭活。
8. 暴露抗原
对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的*修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
9. 封闭
在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭
10. 抗体稀释
应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。
11. 背景高
在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。
12. 返蓝
在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。
13. 显色
一定要在显微镜下观察，注意控制背景。
14. 在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。
15. 拍照
免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在250左右。如果呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄，也不偏蓝。