Biocoat血管生成系统：内皮细胞迁移

D产品货号：354143 354144 354147 354148

储存和运输：-20度储存，干冰运输。

操作指南：

血管生成过程中，内皮细胞活化后表达基质金属蛋白酶（MMPs），可降解血管基底膜。BD Biocoat内皮细胞侵袭系统提供了抗/促血管再生化合物的体外定量实验模型。内皮细胞侵袭系统包括：BD Falcon 24多孔板培养小室，含配套接收板和盖子：BD FluoroBlok荧光屏蔽3.0μm孔径PET膜，预包被Matrigel基质。具体操作步骤如下：

冻融：

从-20℃冰箱中取出包装，使其自然升温到室温。

迁移实验：用BD钙黄绿素Calcein AM荧光染色剂后标记

细胞在BD FluoroBlokTM 基质膜迁移后，采用荧光标记定量，只有迁移到下室的细胞可以计算得到。根据实时动力曲线的计算，推荐使用前标记法。

2.1 原代HUVEC细胞的迁移能力取决于其来源和所传代数。可以先对HUVEC迁移能力进行预筛选，推荐使用所传代数较低，8代以内的HUVEC。

2.2 HUVEC细胞在血清培养基或生长因子VEGF优化的培养基中生长，会对不同的内皮细胞诱导剂产生不同的应激反应。

建议在实验前将细胞饥饿4-5小时，而后去除生长培养基，清洗细胞单层，加入含0.1%BSA的基础培养基（不含血清或生长添加剂）。

2.3 HUVEC细胞悬液可用胰酶消化后制备，然而，采用非酶技术消化细胞，更能保存细胞迁移的应激能力。可采用专业培养基Specialty Media (产品号：S-014-B)作为非酶消化的离散剂。

注意：大部分内皮细胞培养基不具有足够的血清浓度用于终止胰酶的消化。

2.4 接种细胞浓度同实验条件，如细胞来源，培养基，化学诱导物决定。推荐起始浓度为：4.0×105 cells/mL 24孔板或3.3×105个/mL 96孔板。推荐接种体积分别为250μL和75μL.

2.5 推荐的化学诱导物体积分别为24孔板，750微升，96孔板，225微升。

注意：为了减少气泡和优化荧光读板的性能，推荐通过进样口在配套板内添加试剂。

2.6 小室和对照小室在37℃，5%CO2环境下培养22±1小时。

3、细胞迁移的计算：用BD钙黄绿素Calcein AM 荧光染色剂后标记定量。

注意：钙黄绿素的浓度在4-5μg/mL（HBSS溶液）。采用培养基用于荧光染色剂的稀释会引起荧光染色剂自动水解，并带来高背景荧光。

对一块完整的24孔板来说，需要一管溶解于12.5mL HBSS的50μg的染色剂。96孔板则需要2管溶解于25mL HBSS的50μg染色剂。

3.1 在各管50μg钙黄绿素中加入20 μL DMSO，加入150μL 37℃预热的HBSS。将其转入大量的HBSS中，用150μL预热的HBSS清洗荧光染料的容器。

3.2标记有2种方法

*种适用于大规模孔板的自动化加样操作。小室和孔板内的培养基通过加样口添加。通过进料口加入HBSS清洗孔板和膜底部（24孔板需500μL,96孔板需200μL），反复抽吸。在24孔板中加入500μL钙黄绿素，96孔板中加入225μL。

第二种方法是手动操作较水数量的培养板。取出培养小室，轻摇后去除溶液。去除培养基后，将小室转入另一块新的培养板，该培养板在、预先溶有染色剂（24孔板，每孔500μL，96孔板每孔225μL）。

3.3 在37℃，5%CO2环境下孵育90分钟。

3.4 培养小室的荧光定量信息通过荧光板读板机底部读数取得，激发波长494nm ，发射波长517nm。只有迁移后通过Martigel FluoroBlok膜的被标记的细胞才能被检测。

4、迁移研究：DilC12(3)荧光染色预标记法

细胞接种于孔板之前先用染色剂标民，可用于均一化实验，所产 生的实时动力数据可提示细胞通过基底膜侵袭的动力曲线，不需要分解和破坏各个时间点。

4.1 如1.所示冻融。

4.2 不同浓度的各类荧光素对细胞标记的程度不同，标记浓度和时间，接种细胞浓度和化学诱导剂必须预先优化。

4.3 接种密度参见步骤2.在小室内加入0.5 mL 37℃预热的基本培养基，在37℃，CO2环境下孵育15-45分钟，待用。

4.4 培养小室的荧光定量信息通过荧光板读板机底部读数取得，激发波长549nm，发射波长565nm。只有迁移后通过Matrigel FluoroBlok膜的被标记的细胞才能被检测。

5、结果计算

注意：数据可以用相对荧光值RFU或迁移百分比表示，后者在标准化数据处理中更有用。

背景扣除：计算平均背景值，将其从各个孔板中扣除。

迁移百分比%=受化学诱导的跨膜迁移的细胞平均荧光值/不受化学诱导的跨膜迁移的细胞平均荧光值×100

自动化操作注意事项

1 BD Falcon FluoroBlok 24孔板培养小室系统能适用于自动化操作系统。盖子可以用标准机械手取走，也可用吸力取走。

2 为了避免各孔间污染，孔板设定为一个统一的方向。为了培养小室匹配，确保Falcon的商标均在2者上方，面向同一个方向。

3 对于96 孔板培养小室，需使用锥形头或窄孔口的吸头。宽口枪头会粘在储存口上，不利操作。

4 任何规格的枪头都能达到小室的两边。包括50μL，100μL， 200μL，250μL，1000μL。