谷氨酸脱羧酶抗体酶联免疫测定试剂盒

更新时间：2013-06-19

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使用说明书

体外诊断试剂

2005年2月7日

谷氨酸脱羧酶抗体酶联免疫测定试剂盒

-96人份检测-

试剂代码 3802

酶联免疫法检测人血清中

谷氨酸脱羧酶的自身免疫抗体（GAD6bs）

MEDIPAN GMBH

MEDIPAN GMBH 非放射分析试验图标使用说明

体外诊断试剂

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遵照使用说明

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生物学危险品

微量包被盘

清洗缓冲液

酶结合物

底物

终止液

酶结合物稀释液

起始缓冲液

起始稀释液

质控血清

标准品

有的生产许可证包括US 5,512,447 和 EP 0502188.

用途

I 型糖尿病又称胰岛素依赖型糖尿病（IDDM），主要由于分泌胰岛素的胰腺β细胞的慢性自身免疫性损伤所致。很可能是由于环境因素作用与易感基因缺陷人群，而诱发此病。当胰腺β细胞的80-90%被损伤时，临床状况才出现。在*症状出现前，这个细胞损伤的程序可能要持续好几年，并且此病可发生在任何年龄及任何时间。

在临床症状出现前的阶段，针对于β细胞抗原的自身抗体出现在血液循环中，预示着此类疾病的出现。象胰岛素抗体（IAA），谷氨酸脱羧酶（GAD抗体和酪氨酸磷酸酶抗体（又称ICA512或IA2抗体）这些自身免疫抗体，在I型糖尿疾病初发或临床症状出现前就已经存在多年。GAD是一种催化谷氨酸转化为GABA的酶，GAD已经被识别有2种分子量分别为65.000（GAD₆₅）和67.000（GAD₆₇）的同工酶。尽管GAD自身抗体被发现在I型糖尿病患者和极少数的神经紊乱Stiff-man综合症（SMS）患者体内，但GAD自身抗体在此2种病患者体内的连接形式是不同的。

SMS患者体内的自身抗体识别一种线性的和三维空间的结构GAD抗原，而在I型糖尿病患者体内的GAD₆₅自身抗体只识别三维结构的抗原。在近期的患者诊断中，在70-80%的I型糖尿病患者体内可检测出GAD₆₅自身抗体（GAD₆₅ Abs）。

GAD65自身抗体和IA2自身抗体的联合检测对于儿童和成人的I型糖尿病危险性的评估有很好的相关性。

ANTI-ICA与ANTI-GAD联合检验比单独使用ANTI-ICA诊断I型糖尿病更加敏感，更有判定性，比如在I型糖尿病的检测方面。

GAD也出现在一些II型糖尿病病人中，患者多有显著的高血糖。患者在接受口服降糖药物治疗几个月甚至几年后，他们可能会变成胰岛素依赖型患者。因此，此类病人被认为是一种渐进型的I型糖尿病患者。我们常称这种疾病为隐性疾病或成人隐性自身免疫疾病。

此类病人血清中的GAD65抗体的存在是将来胰岛素依赖性的一个敏感和特异的标志。

参考文献

- Batstra M, Anstoot H, Herbrink P: Prediction and diagnosis of type 1 diabetes using ß-cell autoantibodies. Clin Lab 2001; 47:497-507

- Seissler J,.Hatziagelaki E, Scherbaum WA: Modern concepts for the prediction of type 1 diabetes. Exp Clin Endocrinol Diabetes 2001; 109 Suppl 2: S304-S316

- Pozzilli P, Manfrini S, Monetini L: Biochemical markers of type 1 diabetes; clinival use. Scand J Clin Lab Invest 2001;61:38-44

- Schernthaner G, Hink S, Kopp HP et al.: Progress in the

characterization of slowly progressive autoimmune diabetes in adult patients （LADA or type1,5 diabetes）. Exp Clin Endocrinol diabetes 2001; Suppl 2: S94-S108

- Winter WE, Harris N; Schatz D: Immunological markers in the diagnosis and prediction of autoimmune Type 1a diabetes. Clinical Diabetes 2002; 20: 183-191

试验原理

谷氨酸脱羧酶抗体检测试剂是一个酶联免疫方法的分析试验，用于定量检测人血清内的谷氨酸脱羧酶自身免疫抗体（GAD₆₅ Abs）。

本试验体系利用GAD₆₅抗体的二价性，在固相的GAD65和液相的GAD65-生物素之间形成一个桥。首先，来自于样本的GAD₆₅抗体结合到包被有GAD₆₅的微孔盘上。其次，GAD₆₅-生物素结合到这个复合物上。这个结合上的GAD₆₅-生物素的量与样本中的GAD₆₅抗体的含量相关。未结合的GAD₆₅-生物素通过清洗被去除。结合的GAD₆₅-生物素可通过加入的链霉素过氧化酶来定量，再加入呈色底物（TMB），zui后在波长450nm下读取光密度。

病人样本

样本的收集和保存

通过静脉取血。血液凝集后，通过离心分离血清。必要使用脂血或严重溶血的血清样本。不可以使用血浆检测。

样本可在2-8^oC保存zui多3天，长期保存要求放置于-20^oC。

避免反复冻融血清样本。如果要多次使用，在zui初使用时将样本等量分配为几分，保存于-20^oC。

试剂组分

A	微孔盘 12 x 8 可折，包被人类重组GAD₆₅	真空密封，内附干燥剂
B	浓缩清洗液足够稀释至1250ml	125ml 浓缩液
D	链霉素过氧化酶结合物（SA-POD）足够稀释至14ml	0.7ml 浓缩液
E	底物液（3,3´,5,5´- Tetramethylbenzidin）	15ml 备用
F	终止液（0.25M 硫酸）	12ml 备用
G	链霉素过氧化酶结合物稀释液	15ml 备用
H	GAD₆₅-生物素	3瓶冻干粉
J	GAD₆₅-生物素稀释液	2 x 15ml 备用，红色
C I	阴性质控	0.7ml 备用
C II	阳性质控浓度见手册	0.7ml 备用
1 - 5	标准品浓度见手册	5瓶， 0.7ml / 瓶备用

所需材料

- 的移液器 10 - 100 µl

- 多道移液器

- 可弃移液头

- 8腔道清洗器或微盘清洗机

- 滤光波长为450nm及620nm或690nm的酶标仪

- 量筒

- 蒸馏水或去离子水

- 吸水纸或纸巾

- 薄片

规格和保存

谷氨酸脱脱羧酶抗体诊断试剂为96人份检测试剂。可检测40份未知样本以及双孔标准品和质控血清。

每一个组分的有效日期标示于各自的标签上，试剂盒的有效期标示于盒签上。

试剂盒的所有组分必须保存在2-8^oC, 建议放入原始的试剂盒内保存。

使用前的试剂制备

试验前请将样本恢复到室温。小心地轻轻晃动血清样本，使其混合均匀。

请小心的处理下列组分:

微孔盘（A）- 在打开微孔盘之前使其恢复室温。没有使用的盘子应该保存在冰箱内，并且要保存在原包装袋中封闭好，以避免湿气，如此可保存16周。

浓缩清洗液（B）– 配制充足用量的洗液，用去离子水或蒸馏水按照1+9（浓缩洗液B+水）的比例稀释洗液。例如：50ml的浓缩洗液（B）+450ml的蒸馏水。稀释前的洗液不应该有结晶，否则用37^oC温水将其溶解。稀释后的洗液可在2-8^oC保存30天。

链霉素过氧化酶（D） – 配制充足用量的链霉素过氧化酶溶液，用链霉素过氧化酶结合物稀释液G按照1+19（浓缩酶结合物D+稀释液G）的比例稀释。例如：0.25ml浓缩链霉素过氧化酶（D）+4.75ml稀释液（G）。配制好的溶液在2-8^oC稳定16周。

底物液（E） – 底物液（E）避光保存。

GAD₆₅-生物素（H）– 配制充足用量的GAD₆₅-生物素溶液，在试验前用5.5mlGAD₆₅-生物素稀释液（J）直接加入到1瓶冻干的GAD₆₅-生物素（H）中。配制好的溶液在2-8^oC稳定3天。

试验步骤

建议作双孔重复测试

1. 根据试验安排将下列液体加入相应孔中。

- 25 µl 阴性质控品（C I）和各标准品（1 - 5）

- 25 µl 病人样本和质控血清（C II）.

2. 将盘子覆盖，放置室温（18 - 25 °C）温育 60分钟，同时震荡，振速>500rpm.

3. 吸去孔内液体或将盘子快速反扣在吸水纸上倒空液体，以除去孔内的残留物。用300ul

稀释后的清洗液洗3次，每次浸泡5秒钟。

4. 每孔加入100ul重组的GAD₆₅-生物素溶液。

5. 将盘子覆盖，放置室温（18 - 25 °C）温育60分钟，同时震荡，振速>500rpm.

6. 吸去孔内液体或将盘子快速反扣在吸水纸上倒空液体，以除去孔内的残留物。用300ul

稀释后的清洗液洗3次，每次浸泡5秒钟。

7. 每孔加入100ul稀释后的链霉素过氧化酶结合物溶液。

8. 将盘子覆盖，放置室温（18 - 25 °C）温育20分钟，同时震荡，振速>500rpm.

9. 吸去孔内液体或将盘子快速反扣在吸水纸上倒空液体，以除去孔内的残留物。用300ul

稀释后的清洗液洗3次，每次浸泡5秒钟。

10. 每孔加入100ul底物液（E），轻微震荡。

11. 室温避光孵育20分钟。

12. 每孔加入100ul终止液（F）。振荡5秒，振速>200rpm.

13. 加入终止液后5分钟内，以双波长450/620nm或450/690nm测量吸光度。

请注意清洗步骤是十分关键的。不充分的清洗将会导致精密度下降和不真实的吸光度评估数值。如果没有振荡，测得的吸光度值将会下降20%，并且会降低敏感度。

数据处理

标准曲线是通过将测量所得的1-5个标准品的OD平均值为坐标轴的y轴，将与其相对应的1-5个标准品的浓度设为x轴，由此而得。另外阴性质控品也应该用于此标准曲线的建立。（见下）

根据测得的吸光度值，质控品和未知样本中所含的GAD₆₅抗体的浓度（IU/ml）可以直接的从标准曲线获得。

本试验结果分析也可以通过计算机分析软件利用spline半对数曲线获得.

典型实例

请不要用此数据进行试验评估

样本	OD （a） 450 nm	OD （b） 450 nm	OD （均值）	IU / ml

阴性质控（C1）	0.145	0.121	0.133	1
标准品1	0.244	0.283	0.264	5
标准品2	0.351	0.391	0.371	15
标准品3	0.684	0.740	0.712	35
标准品4	1.765	1.868	1.817	100
标准品 5	3.397	3.702	3.550	250
阳性质控（CII）	---	---	---	---
样本 1	0.850	0.857	0.854	41.8

标准曲线

典型实例

参考值

anti-GAD
阴性	< 5.0 IU/ml
阳性	³ 5.0 IU/ml

正如我们通常建立其它的诊断参数那样，对于anti-GAD₆₅的血清抗体水平监测，建议每一个实验室也要建立自己的正常范围及病理学范围。因此，上面给出的参考值范围仅仅提供一个指导。

*的试验数据

标准

Madipan生产的谷氨酸脱羧酶抗体酶联免疫法检测试剂的标准依照WHO的参照制定方法NIBSC 97/550条，GAD₆₅抗体的浓度单位为IU/ml.

线性

依据自身抗体人群的不同特质以及考虑到抗原决定簇对自身抗体的特异性和亲和力，在一些情况下，用阴性人血清稀释GAD₆₅抗体后测得的浓度与理论上所期待的浓度不相符。

特异性和敏感度

使用GAD₆₅抗体浓度为5 IU/ml的临界值（cut-off）测量所得敏感度为92.3%，特异性为98.6%，此浓度显示病人为新近感染I型糖尿病。

检测限制

分析敏感度（检测下限为0 ± 3 SD）为0.8 IU/ml.

以4 IU/ml的浓度测量功能性敏感度的盒内CV值为20%。

盒内差和盒间差

盒内差			盒间差
样本号	浓度均值（IU/ml）	CV （%）	样本号	浓度均值（IU/ml）	CV （%）
1	16	4	5	5	14
2	60	4	6	42	7
3	151	4	7	99	3
4	256	3	8	237	25

方法学限制

用本谷氨酸脱羧酶抗体（anti-GAD）检测试剂对健康人群进行检测，结果应该为阴性。但是，anti-GAD可能也出现在外表上健康的人体内。

在极少数神经紊乱的患者中，约60%的Stiff-man综合征患者的血清中有GAD₆₅抗体。与I型糖尿病患者体内的GAD₆₅抗体比较，来自SMS患者体内的GAD₆₅抗体有很高的效价。因此来自疑似SMS患者的GAD₆₅抗体应该用阴性血清预稀释1：50或1：100倍。SMS疾病患者的GAD₆₅抗体也会出现的脑脊髓液中。

任何临床确诊都不应该建立在单独的体外诊断方法的基础上。医生应该考虑所有的临床的和试验室的检查结果，然后才能够确诊。

试验安排表

请将所有的试剂组份恢复室温，轻微振荡使其混合均匀。

顺序	步骤	材料	详情
1	加样各样本		质控I 25 µl	质控 II 25 µl	检测病人样本 25 µl
2	孵育微孔盘室温放置一小时，同时振荡（ > 500 rpm ）
3	吸液或倒出		微孔盘反扣于吸水纸上
	清洗	清洗溶液	3 x 300 µl	3 x 300 µl	3 x 300 µl
4	加样	GAD₆₅-生物素溶液	100 µl	100 µl	100 µl
5	孵育	微孔盘	室温放置一小时，同时振荡（ > 500 rpm ）
6	吸液或倒出		微孔盘反扣于吸水纸上
	清洗	清洗溶液	3 x 300 µl	3 x 300 µl	3 x 300 µl
7	加样	链霉素过氧化酶结合物溶液	100 µl	100 µl	100 µl
8	温育微孔盘室温放置20分钟，同时振荡（ > 500 rpm ）
9	吸液或倒出		微孔盘反扣于吸水纸上
	清洗	清洗溶液	3 x 300 µl	3 x 300 µl	3 x 300 µl
10	加样	底物液	100 µl	100 µl	100 µl
11	孵育	微孔盘	室温放置20分钟，避光
12	加样和混合	终止液	100 µl	100 µl	100 µl
13	测量吸光度		请于5分钟内在波长450 / 620 nm 或450 / 690 nm下测读

安全注意事项

本试剂于体外使用。请仔细遵照使用说明书。

请注意各组分标签上的有效日期。同样请注意重组试剂的稳定性说明。

不要混合或使用不同批号的试剂。

不要使用来自其它厂商的试剂

加试剂时避免时间差。

不使用时，所有试剂组分都应该在原包装内保存在2 - 8 °C。

在一些试剂中含有少量的（< 0.1 % w/w）叠氮钠作为防腐剂。请不要吞咽或接触皮肤及粘膜。

在试剂制备中所使用的来自人体血液或组织的原材料已经被检测，结果为HBsAg阴性，HIV阴性和HCA抗体阴性。但是，没有试验能够保证此类病毒的存在。因此请按照潜在的危险品来处理所有试剂组分和样本。

由于试剂包含潜在的危险物质，请遵守以下注意事项：

- 当处理试剂材料时请不要吸烟、吃或喝食品。

- 戴防护手套

- 不要通过嘴来吸液。

- 快速擦干溢出物，用消毒剂擦拭受污染的表面。

任何情况下，使用本试剂时都要遵守所有GLP规定以及本试剂的*规定。