逆行神经示踪-荧光金操作流程

荧光金（Fluoro-Gold）操作流程

1.背景简介

荧光金（Fluoro-Gold）的使用与荧光示踪剂基本相同。主要区别在于荧光金注射后存活时间、浓度范围、组织处理及其他组织学技术的兼容性方面更灵活。

2.保存和效期：

荧光金干粉需要4℃避光保存。按要求保存，效期可超过1年。溶解后的荧光金也应4℃避光保存，溶解后效期至少6个月。

3.溶解

 荧光金可以溶解于蒸馏水或0.9%生理盐水中或作为悬浮液于0.2mol/L的中性磷酸盐缓冲液中。

4.染料浓度

荧光金浓度1-10%被广泛应用并取得良好效果。建议起始浓度4%。如果注射部位出现坏死或标记过于强烈，请将浓度降低至2%。如果需要更精确的定量，可参照荧光金分子量532.6Da计算。

5.荧光金注射

A. 压力注射：压力注射是常用的注射方式。注射体积一般1-2ul。

B．离子电渗法：用脉冲电流（打开4-10S，关闭4-10S）1-5A在10-20分钟。

C．晶体-示踪剂的晶体可以从微量移液管的顶端给药。

6.术后生存期

荧光金注射后观察到的逆行标记为2天到2个月。典型的荧光金存活期为3-5天。较长的存活期可增强远端突起的填充，而不会使染料从细胞中扩散。

7.固定

几乎任何固定剂或没有固定剂都可以使用；常用含有4%甲醛的磷酸盐中性缓冲液固定。含有高浓度重金属（如锇、汞）的固定剂会淬灭荧光，而高浓度（超过1%）的戊二醛可能会增加背景荧光。

8. 切片处理：

含有荧光金的组织，可以根据几乎任何组织学检测进行后续操作。包括固定组织的低温恒温切片（10um）、固定组织的冷冻切片（20um）或石蜡包埋（3-10um）组织切片等。冰冻组织切片是常用的。

9. 组合检测方法：

组织切片可以进一步处理，通过第二标记检测，包括：放射自显影，HRP组化染色、免疫细胞化学或第二示踪剂染色或荧光复染等。

10.封片，透明，盖片

切片用明胶包被，风干，浸入二甲苯溶液中，用DPX非荧光封片剂封片。如果与第二示踪剂不兼容，可以选择梯度酒精脱水。如果荧光金与细胞荧光结合检测，切片风干，直接用中性甘油缓冲液（1:2）封片。

11. 检测

荧光金可以通过宽紫外激发滤光片的荧光金显微镜观察。当组织用中性pH缓冲液处理时，会发出金色光。当组织用酸性缓冲液（如pH3.3）处理时，则会发出蓝色。可以使用数码或胶片拍摄（彩色打印使用200-400 ASA film，黑白打印使用类胶片如：TRI-X）。大多数曝光时间为：10-60秒，具体取决于物镜放大倍数和标记强度，30秒曝光时间为平均值。可以通过多次曝光来同时显示荧光金和另一种示踪剂。因此，紫外线与亮场结合，在放射自显影中同时定位荧光金和HRP 或银颗粒。同样，蓝光激发也可以结合FTIC，而绿色激发光可以同时观察碘化丙啶或溴化乙锭（一种荧光复染剂）的红色。

其它关于荧光金应用信息：

注射方法：

对于使用微量注射器或微量移液器进行的压力注射，荧光金应溶解在蒸馏水或0.9%的生理盐水中。荧光金也可以用0.2M的中性磷酸缓冲液制作成悬浮液，但是悬浮颗粒可能会堵塞移液器顶端，因此蒸馏水或0.9%的生理盐水是优选的稀释液。对于离子电渗法，在1M醋酸盐缓冲液（pH3.3）中配置1%荧光金溶液。较好的（经过95%乙醇，水清理）移液管顶端因为10-20um。最佳的离子电渗法参数是：用脉冲电流（打开4-10S，关闭4-10S）1-5A在10-20分钟。

注射位点：

几乎任何中枢或外周神经神经系统结构都可以注射荧光金来进行逆行示踪研究。在外周神经系统中，可以研究神经节和外周靶点。对于周围神经的研究，应切割或损伤神经，并将其浸入或注射5%的荧光金溶液。由于荧光金不会被完整的通道纤维显著吸收，因此必须切割或严重损坏纤维才能吸收染料。

荧光金运输和存活时间：

尽管发生了顺向轴突运输，但是荧光金被用作逆向轴突示踪剂。存活时间是不同的（特别对非常短的存活时间12小时-2天），以最大限度的提高所研究的特定神经元系统中的顺向运输。对于逆行运输，存活时间从4天到14天不等。对于大多数系统来说，7-14天是有效的。尽管长通路（如脊髓到脑干）和大型哺乳动物（如猫，猴子）的通路可能需要更长的存活时间（如14天）。此外，由于荧光金在逆行标记的神经元内保持快速输送，几个月的存活时间也会产生好的结果。对于离子电渗法，建议存活2-5天。据统计，哺乳动物的运输速度为每天2cm，对于冷血动物来讲，速度较慢。

组织处理：

组织处理在使用指南和最早出版物中有详细介绍(Schmued and Fallon, 1986, Brain Research 377:147-154)。由于荧光金在许多溶剂中非常稳定，并且在逆行标记的神经元中保持快速输送，因此其应用与很多组化技术相兼容。它可以与其他逆行示踪剂、免疫荧光、PAP和ABC免疫细胞化学、HRP组化染色、放射自显影、复染（溴化乙锭是优选的荧光复染物）、石蜡包埋和塑料包埋一起使用。然而，如果组织未固定，在水溶液中对组织进行额外处理超过1-2小时，将导致标记神经元的荧光金荧光损失。荧光金在电子显微镜中可能很有用。荧光金可用于大脑切片（已转移到磷酸盐缓冲液中）。切片通常用明胶包被，风干，进入二甲苯中，并用DPX封片剂封片。组织也可以在载玻片上观察，无需进一步处理。可以用梯度醇进行脱水，或者对于免疫细胞组化，切片可以风干，用中性甘油缓冲液（1:2）封片。

检测和拍照：

荧光金通过宽带紫外线（UV）激发荧光显微镜滤光片观察。使用与宽带紫外线下激发的其他荧光示踪剂（如True Blue, Fast Blue, Nuclear Yellow）相同的滤光片包，如：Leitz Phloem filter system A (Wide Band UV, Excitation filter BP 340-380), Mirror RKP 400, Barrier Filter LP 430)。由于塑料会吸收紫外线，因此不建议通过塑料培养皿进行观察。推荐胶片T-Max (Kodak, black & white) and Ektachrome 200 Kodak, color slides)，曝光时间从20s到1.5min不等。

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