FD 快速高尔基染色试剂盒 GolgiStain TM Kit

FD Rapid GolgiStainTM Kit FD 快速高尔基染色试剂盒

神经元和胶质细胞形态学研究的完整 Golgi-Cox 染色试剂盒

使用手册中文版

PK401/PK401A

      I.        介绍

Golgi-Cox 浸染法是研究神经元和胶质细胞正常和非正常形态zui有效的方法之一。 使用 Golgi 技术，在药物处理过的动物脑中和因神经疾病死亡的病人脑中发现了神经 树突和树突微小的形态改变。然而 Golgi 染色法的不可靠性且费时已成为这种方法广泛应用的障碍。

FD Rapid GolgiStainTM Kit(FD 快速高尔基染色法)是根据 Ramón-Moliner，Glaser 和 Van der Loos 所阐述的方法原理设计的。该试剂盒不仅极大地改进并简化了 Golgi-Cox 技术，而且被证实在显示神经元和胶质细胞，尤其是树突棘的形态细节极为灵敏 可靠。北京博蕾德生物代理的 FD Rapid GolgiStainTM Kit 已被广泛用于并用于数种动 物脑组织染色。

II.     试剂盒盒组分

III.  需要但未包括在试剂盒里的物品

1.     双蒸水或 Milli-Q 水

      2.    塑料/玻璃管或瓶

  3.    组织学耗材： 明胶包被的显微镜载玻片（Cat.#PO101） 盖玻片

 染色罐 乙醇 二甲苯

树胶封片剂 Permount®

光学显微镜

IV.        安全操作注意事项

1.   FD Rapid GolgiStainTM Kit 仅用于体外研究，不能用于诊断或其它应用。

2. 试剂盒所包含有试剂是有毒的，吸入或接触皮肤是有害的，如果吞咽可能是致 命的。不要用嘴吸。避免吸入和接触皮肤和眼睛。如果接触，立即用大量的水 冲洗并求助医生。

3. 在化学通风橱下完成实验。操作这些试剂时须穿戴合适的防护服，手套和眼睛 和面部防护罩，完成实验之后把手*冲洗干净。

V.     组织制备

使用此试剂盒前必须仔细阅读以下说明！！

l     所用容器（zui好为塑料材质）必须用蒸馏水冲洗干净。

l     当溶液 A 和溶液 B 存在时不能使用金属器具。

l     保持容器密封。

l     用溶液 A 和溶液 B 处理的组织和切片，应该避光。

l     除非特别指出，以下流程需在室温下完成。

1.    杀死动物之前对实验动物进行深度麻醉。应尽快地从颅骨中取出动物的脑（或病人的脑），但操作时必须非常小心以免损伤或压迫组织。

注意

l 除非*必要，不要对动物进行灌注。如果确实需要对动物进行灌注（用4%的多聚甲醛处理不要超过 5 分钟），一定不要对组织进行后固定处理。

l  体积较大的脑部样本包括大鼠脑部应该用锋利的刀片切成大约 10mm 厚的 块状。

重要提示！

2.    用双蒸水或 Milli-Q 水快速冲掉组织表面的血液。

3.    把组织浸泡在由溶液 A 和 B 等体积混合的浸渍液中，室温下黑暗保存两周*。浸 泡 6 个小时以后或次日更换新的浸渍液。

*对于大多数情况浸泡 2 周是足够的。然而，不同的组织类型及组织的大小不同 可能需要延长或缩短浸泡时间来达到zui佳效果。对于每种类型的组织的浸泡时 间应该通过试验获得，但是对于大多数组织浸泡 3 周是足够的。注意，延长浸 泡时间可能增加染色背景

注意

l  溶液 A 和溶液 B 的混合液至少在用之前 24 小时配制，并不能搅拌。

l   采用以上方案则不会产生沉淀是关键的。

l   制备好的浸泡液在用之前室温黑暗保存可长达一个月。

l   每 m3 待研究组织至少用 5ml 浸泡液。注意用较少的浸泡液可能降低染色 的灵敏性和可靠性。

l   为取得zui佳结果，在浸泡期间每周两次对装有组织的容器可轻轻地左右旋 涡（一定不要晃动！）几秒钟溶液 A 和 B （含有升Hg，重铬酸钾和铬酸钾）接触皮肤是有毒的，如果吞 咽可能是致命的。实验应该在化学通风橱中完成。当操作这些试剂时应穿 戴防护服，手套和防护面具/眼镜。不要把溶液 A 和 B 的废弃物倒进水槽中！ 把溶液 A 和 B 的废弃物收集起来放到一个瓶子中，致电安全办公室或有执 照的专业废物处理服务的部门处理些材料。

4.    转移组织到溶液 C 中室温黑暗至少 72 小时（可长达 1 周）。24 小时后或次日至 少更换一次溶液。

5.    在-20℃到-22℃的条件下用冷冻切片机将组织切成 100-200  um 厚的薄片（进行切片之前请仔细阅读第 4 和 5 页的信息）。也可用其它型号的显微镜薄片切片机包括滑动切片机和振动切片机（具体细节参看第 4 和 5 页）。用样本回收器（试 剂盒提供）把样本转移到含有溶液 C（试剂盒所提供的滴瓶是方便溶液 C 滴到载 玻片上）的明胶包被的显微镜载玻片上（Cat#PO101）。载玻片上多余的溶液用 吸管吸走并用滤纸吸干（载玻片上的溶液必须尽可能地吸干否则切片将从载玻 片上脱落下来）。切片可以室温下自然风干（不能用电风扇或电热板使其干燥）。 为取得zui佳结果，应尽快地完成切片，制备好的切片如果保存于载玻片盒中， 室温黑暗条件下zui长可保存 3 天。

注意

l 为避免组织受冷冻切片机的损害，并尽可能地保持细胞形态学，组织在进 行冷冻切片之前应快速冰冻。比如，组织应按以下描述尽可能地快速冰冻： 把组织放在一个塑料匙中慢慢地浸入含有干冰的异戊烷中预冷（为取得zui 佳结果，温度应保持在-70℃以下并且浸入过程用时 1 分钟，越慢越好）。组织*浸入异戊烷之后，使组织在异戊烷中浸几秒钟，然后再放置干冰上 1分钟以确保组织能很好地冰冻。进行切片之前不要让组织融化。

l 切片机的型号可能会有不同，但所用的型号确保能切厚的切片（比如 100 um）。

l     如果冰冻切片机只有一个温度设置，那么在进行切片之前把温度设置在-22℃ 至少 4 个小时。如果有两个温度设置，那么设置槽内温度比样本温度低 1℃。 请注意大多数情况下-22℃是zui佳的温度，然而，为了更顺利地切出切片并 没有破碎，不同型号的切片机和不同的组织可能需要更高或更低的槽内温 度。

l 对于用冰冻切片机切片，以下几点提示是有益的：1）用蒸馏水把组织固定 于样本盘上，但必须确保组织没有融化（可以在干冰上完成）。组织可以被 固定在任何类型的组织冰冻介质上包括 OCT，但要避免切断介质。不要在 OCT 中包埋组织，如果组织确实需要包埋，用 TFM 替代 OCT。2）组织固定 到样本盘后，放置组织于干冰上 10 分钟，然后立即把固定有样本的样本盘安装到冰冻切片机上，等 5 分钟之后进行切片。3）切好的一些切片（不要 使用防卷板），如果组织温度过低比如切片显示出与刀片平行的裂缝，先等 几分钟再进行下一个切片，否则可继续切。

l  浸泡的脑可用琼脂糖或明胶包埋然后用冰冻切片机切片。然而收集切片时（充满切片槽），必须使用溶液 C。否则切片易干燥裂纹。

l  如果用滑动切片机切浸泡的组织，样本盘和刀片都需维持在较低的温度（0℃ 以下）按照操作手册的描述切片固定在含有溶液 C 的载玻片上是重要的。

VI.    染色步骤

在染色过程中和盖盖玻片之前的任何一步都不要让切片变干

1.    用双蒸水或 Milli-Q 水冲洗切片两次，每次 4 分钟。

2.    把切片置于由 1 份溶液 D，1 份溶液 E 和 2 份的双蒸水或 Milli-Q 水组成的混合液 中 10 分钟。

比如：

溶液 D          10ml

溶液 E     10ml

双蒸水    20ml

注意

l  工作液zui好现配现用，每 100ml 工作液zui多用于 100 张切片（比如小鼠脑）， 根据切片的大小。

l  盛有工作液的瓶子或染色罐必须盖好盖子防止试剂蒸发。

l  为取得zui佳结果，孵育期间应频繁搅拌工作液。

3.    用蒸馏水或 Milli-Q 水冲洗切片两次，每次 4 分钟（蒸馏水应频繁更换新的）。

4.    用结晶紫或硫堇对切片进行复染（可选步骤）。

注意

l  对于复染，延长步骤 3 的时间，比如用冲洗 4 次每次 5 分钟代替原来的冲洗2 次每次 4 分钟，或者更长的时间。

5.    在 50%，75%和 95%的乙醇中对切片进行脱水，每个浓度梯度脱水 4 分钟（不要 跳过任何一个步骤）。

6.    然后在无水乙醇中对切片进行脱水，4 次，每次 4 分钟（不要延长时间）。

7.    在二甲苯中透明，3 次，每次 4 分钟，并且用树脂封片剂对盖玻片进行封片。

注意

l  盖玻片之前切片可以暂时存于二甲苯中几个小时。

l  为取得zui佳结果，zui好用未稀释的封片剂。

l  用 Golgi 染色的切片无论何时都应避光保存。